induksi kalus dari eksplan daun

INDUKSI KALUS DARI EKSPLAN DAUN

I.         Tujuan

1.      Menginduksi terbentuknya kalus pada berbagai macam dan konsentrasi zat pengatur tumbuh.

2.      Menginduksi terbentuknya kalus pada berbagai macam eksplan.

II.      Dasar Teori

Inisiasi pembentukan kalus merupakan salah satu langkah penting yang menentukan keberhasilan teknik kultur in vitro. Kalus merupakan massa sel yang tidak terorganisir akibat pembelahan sel yang tidak terkendali, sebagai respon terhadap pelukaan. Hal ini dimungkinkan karena sel-sel tumbuhan yang secara alamiah bersifat autotrof dikondisikan menjadi heterotrof oleh adanya nutrisi yang kompleks dan zat pengatur tumbuh di dalam medium kultur. Selain, dari luka bekas irisan, kalus juga dapat berasal dari pembelahan sel-sel kambium yang terus membelah dan berproliferasi. Proliferasi sel-sel akan terjadi lebih baik jika eksplan yang digunakan berasal dari jaringan yang masih muda. Sel-sel kalus bersifat meristematis dan merupakan salah satu wujud dari dediferensiasi. Dediferensiasi merupakan reverse dari sel-sel hidup yang telah terdiferensiasi menjadi tidak terdiferensiasi, atau dengan kata lain menjadi meristematik kembali. Dediferensiasi merupakan langkah awal bagi perbanyakan vegetatif dengan teknik kultur in vitro karena merupakan dasar terjadinya primordial tunas dan akar.

Kalus telah berhasil diinduksi dari bermacam-macam eksplan, yang perlu mendapat perhatian pada pemilihan eksplan adalah, harus mengandung sel-sel yang aktif membelah. Semua bagian tanaman yang masih muda (kecambah) sangat responsif untuk induksi kalus. Bagian-bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon, koleoptil, umbi akar wortel yang mengandung kambium dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dideferensiasi menghasilkan kalus.

Pembelahan sel-sel pada kalus dipacu oleh hormone endogen dan eksogen auksin dan sitokinin yang ditambahkan pada medium kultur.kalus juga dapat timbul karena adanya infeksi dari mikroorganisme tertentu seperti Agrobacterium tumefaciens. Kalus yang diakibatkan oleh infeksi Agrobacterium tumefaciens disebut tumor (crown gall). Pembentukan kalus tergantung dari jenis tumbuhan, asal eksplan, umur fisiologi dari tanaman donor dan komposisi medium kultur.

Inisiasi pembentukan kalus dimulai dari hasil pembelahan sel yang terus-menerus pada jaringan induk yang tidak perlu harus berhubungan langsung dengan medium kultur, pertumbuhan yang tercepat terjadi di daerah perifer. Hal ini disebabkan karena pada daerah tersebut ketersediaan hara dan oksigennya lebih baik.

III.   Bahan dan Alat

Bahan :

1.      Medium MS

2.      Daun tapak dara (Catharanthus roseus L.)

3.      Daun tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.)

4.      Clorox (baycline)

5.      Akuades steril

Alat :

1.      Pinset steril

2.      Scalpel steril

3.      Gelas ukur

4.      Erlenmeyer steril

5.      Petridish steril yang telah berisi kertas saring

6.      Laminar Air Flow

IV.   Cara Kerja

1.      Menyiapkan alat-alat (pinset, scalpel, gelas ukur, petridish, Erlenmeyer) yang telah steril dan Medium MS, kemudian memasukkkan ke dalam Laminar Air Flow (LAF). Menyemprot semua alat dan medium dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam LAF.

2.      Menyalakan lampu UV di dalam LAF dan membiarkan selama 15-20 menit.

3.      Mengambil daun tapak dara dan daun tembakau pada urutan ke dua dan ketiga dari pucuk, kemudian mencuci menggunakan deterjen dan membilas dengan air mengalir.

4.      Mematikan lampu UV dan menyalakan lampu neon setelah 15 menit, kemudian memasukkan eksplan daun tapak dara dan daun tembakau, chlorox, akuades steril, gelas ukur, dan Erlenmeyer steril.

5.      Mensterilkan permukaan daun tapak dara dengan cara merendam daun pada larutan Chlorox 10% (menambahkan larutan Chlorox 10 ml ke dalam gelas ukur kemudian menambahkan akuades hingga volume 100 ml) dan digoyang-goyang selama 7 menit. Sedangkan untuk daun tembakau yaitu menggunakan sterilisasi bertingkat dengan merendam daun pada larutan chlorox 20% selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan merendam pada larutan chlorox 10% selama 10 menit.

6.      Membuang larutan Chlorox dan membilas dengan akuades steril sebanyak 3 kali.

7.      Meletakkan daun tapak dara dan daun tembakau ke dalam petridish yang telah dialasi kertas saring.

8.      Memotong daun dengan ukuran kurang lebih 1 cm² dan menanam pada medium MS dengan berbagai macam konsentrasi zat pengatur tumbuh ( untuk daun tapak dara menggunakan NAA: BAP= 1:3, dan untuk daun tembakau menggunakan NAA: kinetin= 1:1).

Menutup botol kultur rapat-rapat (bila perlu diberi karet), kemudian meletakkan di dalam ruang inkubator dengan suhu 25°C dengan cahaya neon 20 watt secara terus-menerus.


 

V.   Pembahasan

Kalus merupakan sel-sel pada eksplan yang membelah secara terus-menerus tidak terkendali, sehingga membentuk massa sel yang tidak terorganisir. Eksplan sendiri yaitu bagian kecil dari tanaman (sel, jaringan, atau organ) yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Pertumbuhan kalus merupakan hasil interaksi antara eksplan, komposisi medium, dan kondisi lingkungan selama periode inkubasi. Untuk mengetahui pengaruh macam eksplan dan macam ZPT beserta konsentrasinya, maka pada praktikum ini dilakukan induksi kalus pada 2 macam eksplan daun yang berbeda, yaitu daun tembakau dan daun tapak dara, serta menggunakan macam dan konsentrasi ZPT yang berbeda ( untuk daun tapak dara menggunakan NAA: BAP= 1:3, dan untuk daun tembakau menggunakan NAA: kinetin= 1:1).

Dari gambar hasil pengamatan (gambar 5.1 sampai 5.3) dapat diketahui adanya pertumbuhan kalus. Pada minggu pertama setelah tanam (gambar 5.1) belum terlihat adanya kalus baik pada eksplan daun tembakau maupun daun tapak dara. Namun, dari kedua eksplan tersebut, eksplan dari daun tapak dara pada ulangan ke-2 dan ke-3 sudah terkontaminasi oleh kapang. Sehingga tidak dapat dilakukan pengamatan lanjutan untuk eksplan daun tapak dara ulangan ke-2 dan ke-3. Terjadinya kontaminasi tersebut dapat disebabkan karena kurang sempurnanya proses sterilisasi. Selain itu, dapat juga disebabkan oleh kesalahan praktikan yang meletakkan pinset/scalpel di atas meja laminar air flow sembarangan.

Pada minggu ke-2 (gambar 5.2) nampak bahwa pada keempat eksplan (3 eksplan daun tembakau dan 1 eksplan daun tapak dara) sudah muncul kalus pada bagian tepi potongan daun. Kalus banyak tumbuh di bagian tepi karena pada daerah tersebut merupakan daerah hasil pelukaan sehingga banyak dibentuk jaringan penutup luka (kalus). Selain itu, ketersediaan hara dan oksigen di daerah tepi/perifer lebih baik.

Pada minggu ke-5 (gambar 5.3) kalus sudah mulai menunjukkan penuaan yang ditandai dengan warna kalus yang semakin gelap. Penuaan tersebut bisa disebabkan oleh kandungan nutrisi media yang menyusut, pemguapan (evaporasi) menyebabkan agar-agar mengeras sehingga menghambat difusi zat hara, akumulasi senyawa toksik pada medium di sekitar eksplan, serta sel-sel yang terdapat di tengah-tengah massa sel kekurangan akan oksigen.

Berdasarkan tabel 5.1, dapat diketahui bahwa eksplan dari daun tapak dara dengan penambahan ZPT NAA dan BAP lebih cepat dalam menumbuhkan/menginduksi terbentuknya kalus dibandingkan eksplan daun tembakau dengan penambahan ZPT NAA dan kinetin. Kalus yang terbentuk dari kedua macam eksplan tersebut setelah ditimbang berat basah dan berat keringnya menunjukkan hasil yang bervariasi. Jumlah kalus yang terbentuk dapat dipengaruhi oleh ukuran eksplan dan panjang atau jumlah daerah yang dilukai pada eksplan. Semakin besar ukuran dan semakin banyak daerah yang dilukai pada eksplan, maka jumlah kalus yang dihasilkan juga semakin banyak. Pada praktikum ini, ukuran eksplan dari daun tapak dara dan tembakau berbeda. Sehingga data berat basah dan berat kering kalus yang didapat tidak bisa dijadikan acuan bahwa eksplan dari daun tembakau menghasilkan kalus lebih banyak daripada eksplan dari daun tapak dara. Selain itu, data berat kalus yang dibandingkan juga tidak seimbang, karena berat dari daun tembakau diperoleh dari hasil rata-rata 3 ulangan, sedangkan dari daun tapak dara tidak dapat dirata-rata karena ulangan ke-2 dan ke-3 mengalami kontaminasi.

Kalus yang terbentuk berwarna putih hingga putih kekuningan dan  bertekstur friable. Tektur friable merupakan tektur yang mudah terpecah-pecah menjadi serpihan-serpihan kecil. 

VI.       Kesimpulan

1.    Induksi kalus dengan menggunakan zat pengatur tumbuh NAA dan BAP (1:3) lebih cepat menumbuhkan/menginduksi kalus daripada menggunakan zat pengatur tumbuh NAA dan kinetin (1:1).

2.    Dari hasil praktikum ini tidak dapat dibandingkan hasil induksi kalus dari eksplan daun tapak dara dan daun tembakau karena eksplan yang ditanam memiliki ukuran yang berbeda, sehingga bila jumlah kalus yang dihasilkan tersebut dibandingkan maka hasilnya tidak akan akurat.

Daftar Pustaka

Manuhara, S.W. Junairiah. Wahyuni, D. K. 2010. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan. Universitas Airlangga. Surabaya.

Pelczar & Chan.1988. Dasar – Dasar Mikrobiologi.UI Press.Jakarta.

Metode sterilisasi eksplan

I.              Tujuan:

1.    Mengetahui metode sterilisasi eksplan.

2.    Mengenal bahan yang dibutuhkan dalam sterilisasi eksplan.

II.           Dasar Teori

Dari semua sumber kontaminasi, kontaminasi dari bahan tanam/eksplan merupakan yang paling sulit diatasi. Untuk itu diperlukan bahan sterilan yang tepat untuk menghilangkan kontaminan dari eksplan. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yang akhirnya mengakibatkan eksplan menjadi mati. Sterilisasi eksplan dengan bahan sterilisasi adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagian permukaan eksplan atau disebut desinfestasi (Muslim, 2010).

Sterilisasi eksplan terdiri dari dua metode atau dua cara yaitu secara mekanis dan secara kimiawi.

a.    Sterilisasi eksplan secara mekanis

Sterilisasi eksplan secara mekanis dugunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging yaitu dengan membakar eksplan di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali. Eksplan keras yang disterilisasi dengan cara ini yaitu tebu, biji salak, bung, buah anggrak dan kapulaga. Sedangkan eksplan yang berdaging antara lain wortel, umbi, bawang putih.

b.    Sterilisasi eksplan secara kimiawi

Sterilisasi eksplan secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun dan anther. Bahan-bahan kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi antara lain:

1.      Sodium hipoklorit

Nama dagangnya adalah Clorox dan bayclin. Konsentrasi untuk steril tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5% - 10% dan waktunya antara 5 – 10 menit. Pembuatan larutan Clorox adalah dengan menuangkan Clorox dan aquades dengan perbandingan 1 : 4 (misalkan 25 ml Clorox dan 100 ml aquades), lalu ditambahkan dengan tween-20 sebanyak satu tetes dan dicampur.

Cara sterilisasi di dalam laminar air flow adalah sebagai berikut: pertama-tama adalah eksplan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi larutan Clorox, kemudian leher Erlenmeyer dipegang dan digoyang-goyangkan dengan arah memutar mendatar selama kurang lebih 3 menit, langkah selanjutnya adalah mencuci bersih eksplan tersebut dengan aquades steril sebanyak 3 – 5 kali, masing-masing selama 3 menit. Setelah selesai eksplan diambil dengan pinset dan diletakkan di atas petridish yang ada kertas saringnya. Dengan demikian eksplan sudah siap untuk disimpan.

2.      Merkuri klorit

Nama dagandnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini harus berhati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasi dengan menggunakan sublimat sama dengan sterilisasi dengan menggunakan Clorox, hanya waktunya lebih pendek karena bersifat keras. Bila sterilisasi terlalu lama dapat menyebabkan kerusakan pada eksplan (berwarna coklat) sehingga eksplan tersebut tidak akan mampu tumbuh menjadi kalus.

3.        Alkohol 70%

Alcohol lebih banyak diperdagangkan dalam bentuk alcohol 95%. Jamur biasanya mati dengan alcohol 70%, sedangkan dalam alcohol 95% masih tetap hidup. Oleh karena itu, alcohol 95% perlu di encerkan menjadi 70%. Caranya adalah sebagai berikut: tuangkan alcohol 95% sebanyak 25 ml ke dalam gelas ukur, kemudian tambahkan aquades sebanyak 70 ml sehingga volume akhir menjadi 95 ml (Manuhara et al., 2010).

III.        Alat dan Bahan

Alat:

1.    Cawan petri steril

2.    Pinset steril

3.    Beker glass steril

4.    Erlenmeyer steril

5.    Skapel steril

6.    Gelas ukur

7.    Pengaduk

8.    Bunsen

9.    Laminar air flow 

Bahan:

1.    Umbi wortel

2.    Daun Chataranthus roseus

IV.        Cara Kerja:

a.    Melakukan sterilisasi umbi wortel secara mekanis

1.    Mencuci bersih umbi wortel dengan detergen dan membilasnya dengan menggunakan aquades steril.

2.    Melakukan sterilisasi umbi wortel dengan cara pembakaran.

3.    Melakukan sterilisasi eksplan wortel dengan cara mengupas kulit luar wortel yang telah dibakar. Pengupasan dilakukan di dalam laminar air flow dan dalam kondisi steril. Setelah mengupas, kemudian membakar wortel kembali lalu mengupas kembali sampai sebanyak tiga kali.

4.    Kemudian memotong wortel tadi dengan ukuran kurang lebih 2 cm lalu menanamnya.

b.    Melakukan sterilisasi daun Cataranthus roseus secara kimiawi.

1.    Melakukan sterilisasi daun dengan larutan Clorox 25% selama 15 menit

2.    Kemudian membilas daun dengan aquades, setelah itu merendam kembali pada larutan Clorox 10% selama 15 menit.

3.    Setelah dua kali merendam dalam clorox, kemudian membilasnya dengan aquades sebanyak tiga kali.

                  4.  Menanam daun muda dalam media.

V.              Pembahasan

     Proses sterilisasi eksplan bertujuan agar eksplan yang ditanam dapat tumbuh dengan baik dan tidak terganggu oleh kontaminan. Metode yang digunakan ada dua yaitu secara mekanis dan secara kimiawi. Sterilisasi mekanis digunakan untuk eksplan yang strukturnya keras, dalam praktikum ini yang digunakan adalah wortel. Sedangkan sterilisasi kimiawi digunakan untuk eksplan yang strukturnya lunak, dalam praktikum ini yang digunakan adalah daun Cataranthus roseus. 

Pada proses sterilisasi wortel, setelah dibakar bagian luar wortel harus dikupas. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali untuk mendapatkan eksplan yang benar-benar streril. Sedangkan pada proses sterilisasi daun Cataranthus roseus, bagian tepi daun harus diiris untuk melukai daun supaya tumbuh kalus. Setalah disterilisasi, eksplan diletakkan pada ruang inkubasi dan diamati apakah eksplan-eksplan tersebut mengalami kontaminasi. Pengamatan dilakukan selama 14 hari.

            Pada eksplan Cataranthus roseus ulangan kedua mengalami kontaminasi sedangkan pada eksplan wortel ulangan ketiga mengalami kontaminasi. Kontaminasi ini terjadi karena metode pada saat melakukan proses sterilisasi alat-alat yang digunakan kurang aseptik, sehingga memungkinkan mikroorganisme lain dapat hidup pada media.

VI.           Kesimpulan

1.    Sterilisasi ekplan ada dua metode yaitu, secara mekanis untuk eksplan yang strukturnya keras dan secara kimiawi yaitu untuk ekslan yang strukturnya lunak.

2.    Bahan-bahan yang dapat digunakan untuk sterilisasi eksplan yaitu sodium hipoklorit, merkuri klorit dan alkohol 70%.

Daftar Pustaka

Manuhara, S.W. Junairiah. Wahyuni, D. K. 2010. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan. Universitas Airlangga. Surabaya.

Muslim, Ahmad. 2010. Sterilisasi Eksplan (Bahan Tanam) Kultur Jaringan. http://mediakulturjaringan.blogspot.com/2010/08/sterilisasi-eksplan-bahan-tanam-kultur.html. 2010.. Diakses tanggal 05 Januari 2012.