Metode sterilisasi eksplan

I.              Tujuan:

1.    Mengetahui metode sterilisasi eksplan.

2.    Mengenal bahan yang dibutuhkan dalam sterilisasi eksplan.

II.           Dasar Teori

Dari semua sumber kontaminasi, kontaminasi dari bahan tanam/eksplan merupakan yang paling sulit diatasi. Untuk itu diperlukan bahan sterilan yang tepat untuk menghilangkan kontaminan dari eksplan. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yang akhirnya mengakibatkan eksplan menjadi mati. Sterilisasi eksplan dengan bahan sterilisasi adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagian permukaan eksplan atau disebut desinfestasi (Muslim, 2010).

Sterilisasi eksplan terdiri dari dua metode atau dua cara yaitu secara mekanis dan secara kimiawi.

a.    Sterilisasi eksplan secara mekanis

Sterilisasi eksplan secara mekanis dugunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging yaitu dengan membakar eksplan di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali. Eksplan keras yang disterilisasi dengan cara ini yaitu tebu, biji salak, bung, buah anggrak dan kapulaga. Sedangkan eksplan yang berdaging antara lain wortel, umbi, bawang putih.

b.    Sterilisasi eksplan secara kimiawi

Sterilisasi eksplan secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun dan anther. Bahan-bahan kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi antara lain:

1.      Sodium hipoklorit

Nama dagangnya adalah Clorox dan bayclin. Konsentrasi untuk steril tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5% - 10% dan waktunya antara 5 – 10 menit. Pembuatan larutan Clorox adalah dengan menuangkan Clorox dan aquades dengan perbandingan 1 : 4 (misalkan 25 ml Clorox dan 100 ml aquades), lalu ditambahkan dengan tween-20 sebanyak satu tetes dan dicampur.

Cara sterilisasi di dalam laminar air flow adalah sebagai berikut: pertama-tama adalah eksplan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi larutan Clorox, kemudian leher Erlenmeyer dipegang dan digoyang-goyangkan dengan arah memutar mendatar selama kurang lebih 3 menit, langkah selanjutnya adalah mencuci bersih eksplan tersebut dengan aquades steril sebanyak 3 – 5 kali, masing-masing selama 3 menit. Setelah selesai eksplan diambil dengan pinset dan diletakkan di atas petridish yang ada kertas saringnya. Dengan demikian eksplan sudah siap untuk disimpan.

2.      Merkuri klorit

Nama dagandnya adalah sublimat 0.05%. Penggunaan bahan kimia ini harus berhati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasi dengan menggunakan sublimat sama dengan sterilisasi dengan menggunakan Clorox, hanya waktunya lebih pendek karena bersifat keras. Bila sterilisasi terlalu lama dapat menyebabkan kerusakan pada eksplan (berwarna coklat) sehingga eksplan tersebut tidak akan mampu tumbuh menjadi kalus.

3.        Alkohol 70%

Alcohol lebih banyak diperdagangkan dalam bentuk alcohol 95%. Jamur biasanya mati dengan alcohol 70%, sedangkan dalam alcohol 95% masih tetap hidup. Oleh karena itu, alcohol 95% perlu di encerkan menjadi 70%. Caranya adalah sebagai berikut: tuangkan alcohol 95% sebanyak 25 ml ke dalam gelas ukur, kemudian tambahkan aquades sebanyak 70 ml sehingga volume akhir menjadi 95 ml (Manuhara et al., 2010).

III.        Alat dan Bahan

Alat:

1.    Cawan petri steril

2.    Pinset steril

3.    Beker glass steril

4.    Erlenmeyer steril

5.    Skapel steril

6.    Gelas ukur

7.    Pengaduk

8.    Bunsen

9.    Laminar air flow 

Bahan:

1.    Umbi wortel

2.    Daun Chataranthus roseus

IV.        Cara Kerja:

a.    Melakukan sterilisasi umbi wortel secara mekanis

1.    Mencuci bersih umbi wortel dengan detergen dan membilasnya dengan menggunakan aquades steril.

2.    Melakukan sterilisasi umbi wortel dengan cara pembakaran.

3.    Melakukan sterilisasi eksplan wortel dengan cara mengupas kulit luar wortel yang telah dibakar. Pengupasan dilakukan di dalam laminar air flow dan dalam kondisi steril. Setelah mengupas, kemudian membakar wortel kembali lalu mengupas kembali sampai sebanyak tiga kali.

4.    Kemudian memotong wortel tadi dengan ukuran kurang lebih 2 cm lalu menanamnya.

b.    Melakukan sterilisasi daun Cataranthus roseus secara kimiawi.

1.    Melakukan sterilisasi daun dengan larutan Clorox 25% selama 15 menit

2.    Kemudian membilas daun dengan aquades, setelah itu merendam kembali pada larutan Clorox 10% selama 15 menit.

3.    Setelah dua kali merendam dalam clorox, kemudian membilasnya dengan aquades sebanyak tiga kali.

                  4.  Menanam daun muda dalam media.

V.              Pembahasan

     Proses sterilisasi eksplan bertujuan agar eksplan yang ditanam dapat tumbuh dengan baik dan tidak terganggu oleh kontaminan. Metode yang digunakan ada dua yaitu secara mekanis dan secara kimiawi. Sterilisasi mekanis digunakan untuk eksplan yang strukturnya keras, dalam praktikum ini yang digunakan adalah wortel. Sedangkan sterilisasi kimiawi digunakan untuk eksplan yang strukturnya lunak, dalam praktikum ini yang digunakan adalah daun Cataranthus roseus. 

Pada proses sterilisasi wortel, setelah dibakar bagian luar wortel harus dikupas. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali untuk mendapatkan eksplan yang benar-benar streril. Sedangkan pada proses sterilisasi daun Cataranthus roseus, bagian tepi daun harus diiris untuk melukai daun supaya tumbuh kalus. Setalah disterilisasi, eksplan diletakkan pada ruang inkubasi dan diamati apakah eksplan-eksplan tersebut mengalami kontaminasi. Pengamatan dilakukan selama 14 hari.

            Pada eksplan Cataranthus roseus ulangan kedua mengalami kontaminasi sedangkan pada eksplan wortel ulangan ketiga mengalami kontaminasi. Kontaminasi ini terjadi karena metode pada saat melakukan proses sterilisasi alat-alat yang digunakan kurang aseptik, sehingga memungkinkan mikroorganisme lain dapat hidup pada media.

VI.           Kesimpulan

1.    Sterilisasi ekplan ada dua metode yaitu, secara mekanis untuk eksplan yang strukturnya keras dan secara kimiawi yaitu untuk ekslan yang strukturnya lunak.

2.    Bahan-bahan yang dapat digunakan untuk sterilisasi eksplan yaitu sodium hipoklorit, merkuri klorit dan alkohol 70%.

Daftar Pustaka

Manuhara, S.W. Junairiah. Wahyuni, D. K. 2010. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan. Universitas Airlangga. Surabaya.

Muslim, Ahmad. 2010. Sterilisasi Eksplan (Bahan Tanam) Kultur Jaringan. http://mediakulturjaringan.blogspot.com/2010/08/sterilisasi-eksplan-bahan-tanam-kultur.html. 2010.. Diakses tanggal 05 Januari 2012.